1.2 rRNA protsessimine

1.2.1. Protsessimisest üldiselt

Kõikides siiani uuritud prokarüootides transkribeeritakse rRNA pika 30S eellasmolekulina ehk prekursorina, mis sisaldab nii funktsionaalseid geeniprodukte – 16S, 23S ja 5S rRNA ning tRNA(d) – kui ka nende vahel paiknevaid ning nendega külgnevaid lisajärjestusi (joonis 3). E. coli puhul moodustavad need lisajärjestused rRNA operonist ligi 25%. rRNA protsessimiseks nimetatakse sündmuste ahelat, mille käigus toimuvate nukleolüütiliste lõikamiste tulemusena tekivad lõpliku pikkusega rRNA molekulid. 

Protsessing toimub kahes etapis. Esmalt leiavad aset primaarsed lõikamised, mille tulemusena eraldatakse funktsionaalsed geeniproduktid üksteisest. See juhtub veel enne transkriptsiooni lõppemist, kui RNA pole veel seostunud ribosomaalsete valkudega (r-valkudega). Teise etapina toimuvad sekundaarsed lõikamised, mille lõppedes on moodustunud küpsetele rRNA molekulidele iseloomulikud 5’- ja 3’-otsad. Selles etapis on substraadina vajalik ribonukleoproteiinpartiklite (RNP) olemasolu. Protsessing on kiire ja enamus rRNA’st leidub E. coli rakkudes küpsete molekulidena. Vaid 1-2 % rRNA’st esineb pikkade prekursoridena. 

Esimene ensüüm, mis leiti osalevat protsessingul, oli RNaas III. Nimelt märgati, et E. coli mutandis AB 301/105, milles RNaas III puudus, akumuleerus 30S rRNA. Samade katsetega tõestati, et prokarüootne rRNA sünteesitakse esmalt pika prekursorina. Veidi hiljem selgus, et 30S rRNA lõikamine RNaas III’ga in vitro annab tõesti tulemuseks 16S ja 23S molekulid, kuid need on pikemad kui metsik-tüüpi rakkudes leiduvad. RNaas III aktiivsuse tulemusena eralduvad p16S (prekursor-16S), p23S, p5S rRNA ja ptRNA molekulid (joonis 3). 

RNaas III lõikab kaheahelalisi RNA struktuure, mis moodustuvad transkriptsiooni käigus 23S ja 16S rRNA geenidega külgnevate järjestuste paardumise tulemusena. Niisuguste protsessing-stemide moodustumine on prokarüootide hulgas evolutsiooniliselt konserveerunud. Erinevate rrn operonide RNaas III lõikamissaitide vahel esineb tugev nukleotiidsete järjestuste homoloogia, v. a. üksikud erinevused paardumata positsioonides. 
 


Joonis 3. rRNA protsessingut läbiviivad ensüümid ja nende lõikamissaitide asukohad rrn operoni transkriptil. rRNA ja tRNA struktuurgeenid on näidatud paksu joonega. RN0aaside lõikamiskohad on tähistatud nooltega.

RNaas III võib in vitro lõigata primaarset rRNA transkripti, kasutades substraadina nii vaba RNA’d kui ka preribosoome, kuid protsessingu lõplikuks toimumiseks on kindlasti vajalik kompleksi moodustumine rRNA ja r-valkude vahel. 
Arvatakse, et RNaas III’e äratundmissait pole seotud mingi kindla RNA nukleotiidse järjestusega. Katsed näitavad, et oluline on sekundaar- ja tertsiaarstruktuur. Ilmselt on RNaas III spetsiifika määratud eelkõige kaheahelalise RNA olemasoluga. Ühe ahela deletsioon takistab ka teise ahela lõikamist. 

E. coli tüved, millel RNaas III puudub, on sellest hoolimata elujõulised, kuid nad kasvavad veidi aeglasemalt ning on näidatud, et nad transleerivad beeta-galaktosidaasi ja teisi mRNA’sid defektselt. 

Protsessingu uurimiseks kasutati varem ribonukleoproteiinpartiklite lahutamist sahharoosgradiendil ning sellele järgnevalt protsessingu produktide analüüsi geelelekroforeesil. Uuemad meetodid võimaldavad protsessingut uurida nukleotiidide tasandil, kasutades Northern hübridisatsiooni, praimeri ekstensiooni, S1 nukleaasi töötlust jne. Uuringutele aitab tõhusalt kaasa mitmesuguste RNaaside poolest defektiivsete mutantide olemasolu.
 

1.2.2. 16S rRNA protsessimine

Primaarses transkriptis moodustub 16S rRNA’ga külgnevatest järjestustest ligikaudu 80 aluspaari pikkune stem-struktuur, mille lõikab katki RNaas III. Selle tulemusena tekib p16S rRNA ehk 17S rRNA, mis omab 5’-otsas 115 ja 3’-otsas 33 lisanukleotiidi. Pärast primaarset lõikamist allesjääva stem-struktuuri pikkus on 26 aluspaari. p16S omab nii 3’ kui ka 5’ otsas märksa rohkem lisanukleotiide kui p23S rRNA.

p16S molekulid tekivad ka RNaas III- tüvedes, kuid need omavad metsik-tüüpi p16S molekulidega võrreldes 5’ ja 3’ otstes veelgi rohkem lisanukleotiide. Ehkki nendes tüvedes ei tuvastatud 16S eellasmolekulidel RNaas III lõikamiskohtade läheduses endonukleaasset aktiivsust, moodustusid sellest hoolimata normaalsete otstega 16S molekulid ja sama kiirusega nagu metsik-tüüpi rakkudes. Need tulemused lubavad oletada, et lõpliku valmimise eest vastutavad ensüümid töötavad RNaas III lõikamisest sõltumatult.

Siit tulenevalt on 16S rRNA valmimise peamine iseärasus, et reaktsioonide järjekord pole üheselt määratud. RNaas III lõikamine pole raku eluks hädavajalik, ehkki metsik-tüüpi rakkudes see reeglina siiski toimub. Pole teada, millised ensüümid vastutavad 17S rRNA moodustumise eest RNaas III- tüvedes. On avaldatud arvamust, et tegu võiks olla mittejärjestusspetsiifiliste nukleaasidega, mis lõikavad ssRNA'd. 

Nii tööd RNaas III- tüvedega kui ka uuringud in vitro kinnitavad, et küpse 16S rRNA tekkimiseks on vajalikud eraldi endonukleolüütilised lõikamised nii 5’ kui ka 3’ otsas. Eksonukleolüütilise aktiivsuse olemasolu näitavaid intermediaate pole tuvastatud.

Asjaolu, et 16S rRNA 5’- ja 3’-otsad produtseeritakse erinevate ensüümide abil, saab demonstreerida E. coli BUMMER-tüvel, millel puudub endonukleaas RNaas M16. Selliste mutantide rakkudes akumuleerub prekursor 16S rRNA, sedimentatsioonikoefitsendiga 16,3, millel on küps 3’-ots, kuid 5’-otsas paikneb 66 lisanukleotiidi. 16,3S rRNA’st küpse 5’-otsaga 16S rRNA genereerimise eest vastutav RNaas M16 ei lõika puhastatud 16,3S rRNA’d, vaid vajab substraadina 30S või 70S ribosoome. 

Mutantidel, millel puuduvad RNaas E ja RNaas G (Caf A valk), blokeerub 16S rRNA 5’-otsa valmimine täielikult ja akumuleerub 17S rRNA, kuid samade ensüümide olemasolul toimub küpse 16S molekuli moodustumine. Vastavalt Li ja kaasautorite mudelile (joonis 4) lõikab RNaas E pärast RNaas III’e poolt sooritatud esmast lõiget, andes tulemuseks 66 lisanukleotiidiga 5’-otsa. Seejärel lõikab RNaas G ja nii saadakse küps 5’-ots. Kui RNaas E puudub, võib RNaas G siiski lõigata, kuid reaktsiooni efektiivsus on tunduvalt madalam. Kui puudub RNaas G, saab RNaas E samuti veidi toota küpset 5’-otsa, kuid sel juhul on reaktsioon taas aeglane ja ka ebakorrektne, jättes 5’-otsa alles 5 lisanukleotiidi.

Samas töös on näidatud, et kuna RNaas G puudumisel kuhjub rakus 5’-otsas 66 lisanukleotiidi omav produkt, siis annab see alust arvata, et eelnevalt mainitud BUMMER-tüvi on defektne RNaas G poolest.

Pole teada, milline ensüüm vastutab 16S rRNA 3’-otsa valmimise eest. Vastava aktiivsuse olemasolu on täheldatud, kuid lähem kirjeldus puudub tänaseni. Ilmselt osaleb 3' otsa protsessimisel endonukleaas, kuna intermediaate pole leitud.

On oluline märkida, et 16S rRNA 3’ otsa protsessingu toimumine on hädavajalik, kuna p16S rRNA’d sisaldavad 30S ribosoomid on bioloogiliselt inaktiivsed. Inaktiivsust võib põhjustada asjaolu, et 16S rRNA 3' otsas paikneb nn. anti-Shine-Dalgarno järjestus, mis omab tähtsat rolli valgusünteesi initsiatsioonifaasis. 16S rRNA peab võtma mRNA’ga paardumiseks ja initsiatsioonifaktorite seondumiseks optimaalse konformatsiooni. 
 


Joonis 4. 16S rRNA protsessimine E. coli'l. Näidatud on ribonukleaaside lõikamiskohad.
 
 

1.2.3. 23S rRNA protsessimine

23S rRNA eraldab teistest 30S transkripti osadest RNaas III, mis lõikab 23S rRNA geeniga külgnevatest järjestustest moodustunud kaheahelalist regiooni.

Erinevalt 16S rRNA valmimisest on 23S rRNA otste lõplik valmimine otseselt sõltuv RNaas III’e poolt teostatavast protsessingust, kuna valmis 23S rRNA molekule ei ole RNaas III- tüvedest leitud. Selle asemel moodustub nendes tüvedes heterogeenne p23S rRNA’de populatsioon, kuhu kuulvad p23S rRNA'd omavad 5' otsas 20...97 lisanukleotiidi ning samuti lisanukleotiide 3' otsas. Lisaks on nii RNaas III- tüvedes kui ka metsik-tüüpi tüvedes leitud liik 23S rRNA’d, mis on 5’ otsast 4 nukleotiidi lühem kui küps 23S rRNA. Arvatakse, et see liik võiks samuti olla aktiivne ja  omada mingit rolli raku metabolismis. Erinevalt 16S rRNA puhul jälgitust on RNaas III- tüvedes leiduv lõplikult protsessimata 23S rRNA piisav funktsionaalsete ribosoomide saamiseks, ehkki sellised rakud kasvavad aeglasemalt. 23S rRNA 3' ja 5' otsad paiknevad 50S subühikus L1 valgu sidumissaidi vastas. p23S rRNA’d on leitud ka metsik-tüüpi rakkudest eraldatud polüsoomidest ja näib, et lisajärjestused 23S rRNA otstes ei blokeeri peptiidsideme moodustumist ega translokatsiooni.

Kui puhastatud RNaas III’e abil protsessida 23S rRNA molekule in vitro, kasutades substraadina RNaas III– tüvest eraldatud pre-23S rRNA’d, 50S või 70S ribosoome, siis saadakse tulemuseks 23S rRNA, mille 5’ otsas on 3 või 7 lisanukleotiidi ning 3’ otsas 7-9 lisanukleotiidi. Küps 5’ ots moodustub vaid siis, kui katses luua valgusünteesile sarnased tingimused, või kasutades substraadina polüsoome, kusjuures eelistatuimaks substraadiks on polüsoomid. Seega lõplik 5’ otsa valmimine vajab tundmatut ensüümi, mis tõenäoliselt kasutab substraadina RNaas III lõikamisel tekkinud ning polüsoomides erilise konformatsiooni saavutanud produkti. See ensüüm näib olevat endonukleaas, sest vaheprodukte pole märgatud.

p23S rRNA 3’ otsast lisanukleotiidide eemaldamisel osalev ensüüm oli samuti kaua aega tundmatu. Teati vaid, et see peaks olema eksonukleaas, kuna oli vaadeldud intermediaate. Hiljuti näidati, et 23S rRNA küpse 3’ otsa valmimiseks on vajalik eksoribonukleaas RNaas T, kuna RNaas T puudumisel akumuleeruvad rakus protsessimata 3’ otsaga prekursorid ja puhastatud RNaas T suudab efektiivselt läbi viia 3’ otsa valmimisprotsessi in vitro. Tuleb märkida, et RNaas T- rakkudes akumuleeruvad prekursorid on lühemad, kui RNaas III’e aktiivsuse tulemusena tekkinud produktid, mis lubab oletada teiste eksoribonukleaaside osalemist (joonis 5). Ent üksnes RNaas T suudab efektiivselt eemaldada viimased nukleotiidid, kusjuures protsess toimub efektiivsemalt, kui substraadina kasutada mitte isoleeritud RNA'd vaid ribosoome. Seega ka 23S rRNA 3’ otsa valmimist mõjutab korrektne RNA konformatsioon ja võib-olla ka interaktsioonid ribosoomi valkudega. 
Ehkki 23S rRNA 3’ ja 5’ ots on paardunud, näib nende valmimine toimuvat üksteisest sõltumatult.
 


Joonis 5. 23S rRNA protsessimine E.coli'l. Näidatud on ribonukleaaside lõikamiskohad. 
 
 

1.2.4. 5S rRNA protsessimine

E. coli 5S rRNA valmimine toimub mitmeastmelise protsessi tulemusena. 
Pärast RNaas III’e lõikeid vabaneb primaarse 30S transkripti 3’ osa p16S ja p23S rRNA molekulidest ning alles jääb fragment, mida nimetatakse ka 9S eellasmolekuliks. Kui operonil paikneb 5S rRNA geenist 3' suunas veel üks või kaks tRNA geeni, siis eraldatakse need tRNA geenid RNaas P aktiivsuse tulemusena.

RNaas III’e (ja RNaas P) aktiivsuse tagajärjel jääb primaarsest transkriptist alles 5S rRNA molekul, mis omab 5’ otsas 85 lisanukleotiidi ja samuti lisanukleotiide 3’ otsas. See intermediaat akumuleerub RNaas E temperatuuritundlikes mutantides, kui neid kasvatada ebasobival temperatuuril. Metsik-tüüpi rakkudes pole sarnast molekuli võimalik RNaas E kiire lõikamise tõttu näha. RNaas E eemaldab lisajärjestusi nii 5’ kui ka 3’ otsast, andes tulemuseks p5S rRNA, mis kannab siiski mõlemas otsas 3 lisanukleotiidi. RNaas E- tüvedes küpseid 5S rRNA molekule ei esine.

Kuna on leitud 5S liike, millel leidub 1, 2 või 3 lisanukleotiidi, on teada, et 5S valmimine vajab 5’ ja 3’ eksonukleaase. Kasutades E. coli mutante, millel puudusid erinevad 3’-5’ eksoribonukleaasid, selgus, et 5S rRNA 3’ otsa valmimiseks on vajalik eksoribonukleaas RNaas T. RNaas T- tüvedes 3’ ots ei valmi ning akumuleerub kahe lisanukleotiidiga produkt. Kuid ka RNaas T- rakkudes, kus lisaks 5S rRNA’le ka 23S rRNA 3’ otsad pole  lõplikult valminud, töötavad ribosoomid üpris hästi. 5S rRNA 5' ja 3' otste valmimine toimub teineteisest sõltumatult.

Pre-5S rRNA’d on sarnaselt pre-23S rRNA’le leitud rakus polüsoomidest,  kus valmimine kõige tõenäolisemalt toimub.
 
 

1.2.5. tRNA protsessimine

 E. coli rrn operonid sisaldavad lisaks rRNA geenidele ka tRNA geene. 16S ja 23S rRNA geenide vahel paikneb üks (operonid rrn B, C, E, G) või kaks (operonid rrn A, D, H) ja 23S geenist allavoolu sõltuvalt operonist lisaks üks (rrn C) või kaks (rrn D, H) tRNA geeni. Kuid enamik tRNA geenidest paiknevad E. coli genoomis mitmeid erinevaid tRNA geene kandvate operonidena.

 tRNA molekulide 5’ otsa lõpliku valmimise eest hoolitseb RNaas P. 3’ otsa  protsessimine on keerulisem ja pole tänapäevani täiesti selge. Endonukleolüütiline lõikamine jätab mõnel juhul 3’ otsa alles mõned lisanukleotiidid, mis tõenäoliselt eemaldatakse eksoribonukleaaside abil. Selle tulemusena jääb vabaks tRNA CCA järjestus, mille külge liidetakse aminohape. Üllatava tulemuseni jõudis Deutscher, kes leidis, et rakkude kasv lakkab alles siis, kui E. coli’st on eemaldatud viis 3’-5’ eksoribonukleaasi (RNaas II, D, BN, PH, ja T). Edasised uuringud mutantidega näitasid, et oluliseimat rolli tRNA 3’ otsa valmimisel kannavad RNaas T ja RNaas PH. In vitro katsetest selgus, et RNaas PH substraadiks sobib tRNA intermediaat, mis omab 3’ otsas 4-6 lisanukleotiidi. Kui RNaas PH aktiivsuse tulemusena on alles jäänud vaid 2-3 lisanukleotiidi, lülitub tööle RNaas T ning eemaldab viimased lisanukleotiidid. Katsetest ei selgunud, kas kas RNaas PH üksi suudab lühendada tRNA normaalse pikkuseni.

 Olgu veel mainitud, et E. coli tRNA valmimine erineb olulisel määral Bacillus’e puhul toimuvast, kus endoribonukleaas RNaas M5 vastutab mõlema tRNA otsa valmimise eest.
 
aniback1.gif (2077 bytes)